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非變性蛋白電泳Marker轉(zhuǎn)膜問題

非變性蛋白電泳Marker轉(zhuǎn)膜問題

 

1. 所有的預(yù)染蛋白Marker都是變性Marker,不適用于非變性電泳。

2. 蛋白非變性電泳條件下,不能精確判斷蛋白的分子量大小。因?yàn)樵诜亲冃詶l件下,蛋白的電荷,空間結(jié)構(gòu),物化性質(zhì)等都對(duì)蛋白的遷移有影響。

3. 非變性蛋白電泳Marker(RTD6137RTD6142,RTD6144)由于要保持蛋白的天然結(jié)構(gòu),都沒有偶聯(lián)染料,在電泳時(shí)基本都看不到條帶;然而,RTD6137和RTD6144中的440 kD和880 kD由于天然蛋白中含有鐵離子,使得電泳后在膠上可見淡黃色,其中440 kD顏色更深。凝膠轉(zhuǎn)膜后,膜上也可以看到黃色的440 kD條帶(下圖),可以大體判斷Marker轉(zhuǎn)膜的效果。


4. 有兩種方法可以解決非變性Marker轉(zhuǎn)膜后條帶顯示問題:

第一種方法:凝膠轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染色液(貨號(hào):RTD6301)染膜,可以看到Marker條帶,順便可以檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效率,然而要注意的是麗春紅染色靈敏度比較低,可能不能完全看到完整的Marker條帶。



       注:北京師范大學(xué)惠贈(zèng)圖片

第二種方法(下圖):電泳結(jié)束后,把含有Marker泳道的凝膠切下,單獨(dú)用考馬斯亮藍(lán)染色液染色(貨號(hào):RTD6202),剩余的凝膠去完成轉(zhuǎn)膜到ECL發(fā)光檢測(cè)過程,最后的發(fā)光結(jié)果和Marker染色結(jié)果拼接判斷條帶范圍。

Jurkat 無去垢劑提取TP,GAPDH檢測(cè)(pI~8.6):
凝膠:RTD6139-0416 BN預(yù)制膠
電泳:1×藍(lán)色電泳緩沖液(含0.002% G-250)
穩(wěn)壓150V 45分鐘;1×無色電泳緩沖液 穩(wěn)壓150V 46分鐘
膠浸泡:1×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液(含20%甲醇)+0.1%SDS浸泡10分鐘
轉(zhuǎn)膜:1×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液(含20%甲醇),穩(wěn)流200 mA
(電壓89-81V) 1.5小時(shí),未冰浴
膜漂洗去藍(lán)色:PVDF膜無水甲醇浸泡10分鐘至膜無色
封閉:無蛋白快速封閉,RT,30分鐘
一抗:GAPDH抗體,1:5000 RT 一小時(shí)
二抗:羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 1.5小時(shí)
ECL:ECL發(fā)光,機(jī)器拍照,曝光2min

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