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Tricine多肽電泳參考文獻

何時使用Tricine-SDS-PAGE檢測小分子肽?

如果你感興趣的蛋白小于20KD,你就要使用Tricine-SDS-PAG系統(tǒng)來分離小肽了。Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)是可以分離1-100KD的蛋白質。此系統(tǒng)最適合分離低于30KD的蛋白質。

相關產(chǎn)品:超低分子量蛋白電泳試劑盒(貨號:RTD6120)

Tricine-SDS-PAGE與傳統(tǒng)SDS-PAGE的區(qū)別:

分離膠中更高的Tris濃度:終濃度為0.75M;普通SDS-PAGE0.375M

分離膠和濃縮膠中的pH都是8.45

分離膠中更高的交聯(lián)度(C-5%,普通的SDS-PAGE為C一般為3.3%。

小肽的電泳:

關于陰極緩沖液和陽極緩沖液

Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)不同于常規(guī)的SDS-PAGE,使用兩種緩沖液電泳。電泳槽內槽是1×陰極緩沖液,含有TricineSDS。外槽是1×陽極緩沖液,是0.2M Tris。由于電泳槽內外槽緩沖液不一樣,電泳前要檢測電泳槽是否漏液,如果漏液的話將導致內外槽緩沖液混合,導致電泳結果不好。如果發(fā)現(xiàn)內槽緩沖液漏液,可以將外槽緩沖液加滿到和內槽緩沖液齊平。

關于電泳時的電壓:

濃縮膠一般用穩(wěn)壓80-100V,如果使用新鮮的緩沖液,這時的電流應該在20mA左右,如果電流太小,請檢查緩沖液以及電泳設備是否有問題。當指示前沿至濃縮膠和分離膠交界時,電壓可以調高到120-150V。整個電泳時間約需2-3小時。

關于電泳的指示前沿:

由于溴酚藍在Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)中泳動很快,很快就跑到緩沖液中去了。超低分子量蛋白Marker2×Tricine 上樣緩沖液中的指示前沿是考馬斯亮藍G-250。電泳中只要指示前沿跑不丟,小肽就不會跑丟。然而,考馬斯亮藍G-250作為指示前沿的缺點是在分離膠中比較彌散。如果電泳時間較短,染色時會遮擋3KD左右的小肽。

小肽的染色:

由于小肽還有較少的氨基酸,染色時結合的染料就少,導致染色靈敏度比較低。上樣時要加大上樣量。另外,低于5KD的小提容易從PAGE膠上脫離,染色前最好有個固定步驟(0.5%戊二醛,30%乙醇)。為了更好的染色小肽,可以選擇FastBlue蛋白染色液Cat NoRTD6202,該產(chǎn)品除具有染色快,無毒,靈敏性高等特點外,還能對小肽在染色中起到固定作用,不至于小肽在染色和脫色中從凝膠中脫離,是常規(guī)染色液的理想替代品。

 小肽的轉膜/Western Blot實驗

由于小肽比較小,轉膜時要注意小肽非常容易透過PVDF膜。兩種方法可以解決這一問題:兩張PVDF膜重疊在一起;縮短轉膜時間(半干法轉移,200mA 15-20分鐘就可以了)。轉膜使用0.22 μmPVDF膜。濕轉(轉膜緩沖液加20%甲醇,不加或少加SDS,200mA 30-35分鐘)。

 小肽電泳文獻:

1 Schagger, H. & von Jagow, G. Tricine–sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1–100 kDalton. Anal. Biochem. 166, 368–379 (1987). PDF下載

最原始小肽電泳的文獻。

2 Schagger, H. Tricine–SDS-PAGE. Nature Protocols. 1,16-23,2006  PDF下載

87年的作者SchaggerNature Protocols 開刊文章,寫的精細,值得推薦。

兩篇國內文獻,主要討論尿素的作用。

多肽的電泳分離 2004

有效分離1kDa小肽的Tricine-SDS-PAGE方法 2004

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